Optimización de la PCR
En la práctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:
- La PCR es una técnica de gran sensibilidad, es decir, necesita
una mínima cantidad de ADN para obtener un gran número de copias.
Además, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en
condiciones inadecuadas de esterilidad,
que conduzcan a la amplificación de ADN no correspondiente a la muestra
a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). Se han de tomar una
serie de precauciones para evitar la contaminación con ADN
extraño. Ejemplos en los que es especialmente importante evitar la
amplificación son la detección de enfermedades (para no diagnosticar
erróneamente a los pacientes) o el diagnóstico de identidad y parentesco. Posibles precauciones son:
- Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificación: recogida, envío, custodia y procesado de muestras.
- Limpieza exhaustiva y esterilización (lejía, etanol, luz UV, psoralenos...) de la superficie de trabajo entre la realización de una PCR y la siguiente.
- En laboratorios de diagnóstico genético, se suelen tener áreas separadas de trabajo: un laboratorio para la preparación de la mezcla madre para la PCR, otro para la adición del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.
- Cabinas de seguridad biológica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades.
- Protección adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes, bata, cubrezapatos, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnóstico molecular es conveniente que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.
- Controles positivos y negativos.
- Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una amplificación no esperada se podrá comprobar si proviene de uno de los operarios.
- Las técnicas de diseño de cebadores son importantes en la mejora de la obtención de productos de PCR y en evitar la formación de productos falsos. Algunas consideraciones al diseñar estos cebadores son:
- Se recomienda usar primers de más de 15 nucleótidos (18-30 nn) Normalmente, se suelen diseñar de 20 nucleótidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy específica, y los que se excedan en longitud harán que perdamos rendimiento en la reacción.
- Los primers no deben diferir en más de 3 bases.
- La proporción entre bases púricas y pirimidínicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 o 2 bases púricas.
- Se requiere una distribución homogénea de los cuatro nucleótidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.
- La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en más de 5 °C.
- Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre sí, o se formarán dímeros entre ellos.
y ésto sólo es un pequeño ejemplo.. hay más cosas a considerar..
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